光合细菌的营养分析和毒理评价研究报告

前言

光合细菌（photosynthetic bacteria.PSB）的培养液应用于畜禽，水产养殖，已有很多报道，也进行了各种层次的研究，但尚未具有系统的营养学和毒理学方面的评价。本文以从PSB培养液中收集的菌体（PSBAD）和PSB培养液为实验材料，对菌种蛋白的生物学效应作了较为完整的营养学与毒理学评价。

评价系统和方法

根据卫生部营养学和毒理学评价系统以及农业部有关饲料质量评价之有关方法，组成以下三大部分评价测试方法。

一、营养学评价
1、PSBAD主要营养组份测定
（1）粗蛋白测定----凯氏定氮法
    取PSBAD1克消化定容到100ml，取消化液5ml于凯氏定氮器中，以0.0485N的盐酸滴定氮。
（2）脂肪测定---索氏抽提法：
    取PSBAD5克，将滤纸包和滤纸筒放入提取管内，提取瓶加入2/3体积的无水乙醚，乙醚蒸发后，再烘烤二小时，称量计算。
（3）还原糖测定------斐林氏滴定法：
    取5克样品，溶解后，移入250ml的容量瓶中，加入7%硫酸铜10ml，4%氢氧化钠4ml，加蒸馏水至刻度，静置半小时，将样液倒入滴定管，吸取斐林A、B液各5ml于三角瓶中，按斐林氏溶液的标定方法进行滴定。
2、PSBAD的表观消化率，净利用率和生物价
（1）实验动物：
    选用上海医科大学实验动物中心纯种Spragul-Dawley成年大白鼠10只，雄性，体重310—330克，实验前，单笼适应性喂养二天，摄食饮水自由。
（2）饲料配制：
    干燥后的PSBAD与其它营养物质混合，PSBAD作为饲料中蛋白质的唯一来源，配制后的饲料基础热量近370Kcal/100g，每100克饲料中，热量百分比为蛋白质10%，脂肪25%，淀粉55%。
（3）计算方法：
    单笼适应性喂养二天后，将表面拌有洋红色的饲料喂养动物，从收集第一次排出的带有洋红色的粪便开始，同时定时收集尿液，连续五天，计算每只大白鼠食入饲料量，以凯氏定氮法计算大，小便中的氮的含量，然后计算饲料蛋白质的表观消化率，净利用率和生物价。
    蛋白质表观消化率=（食物中被消化吸收氮的数量）/（食物中含氮总量）
    蛋白质净利用率=（氮储留量）/（氮摄入量）
    生物价=（蛋白质净利用率）/（表观消化率）

二、毒理学评价
1、大鼠急性口服毒性试验
    选用江西省畜牧兽医研究所动物饲养室的SD大鼠6只，3雄3雌，体重175—240克，染毒浓度为0.23g/ml，鉴于灌服量较大，宜在4小时内分二次灌服，中毒后观察二周，尸解，病理切片镜检。
2、骨髓嗜染红细胞微核试验：
    选用江西省畜牧兽医研究所动物饲养室的ICR小鼠，分四组，共40只，每组雌雄各半，体重20—28克，计有阴性对照组（2%淀粉），阳性对照组（环磷酰胺20mg/kg体重），PSBAD高剂量组（1/5LD50）和低剂量组（1/10LD50）。除阳性对照组每天腹腔注射外，其余各组每天灌胃一次，连续五天，于第五天晨处死，取双侧股骨，以小牛血清将骨髓冲出，离心，弃上清液，取沉淀物推片染色，镜检1000个嗜染红细胞微核数，以千分率表示。
3、精子畸变试验
   选用江西省畜牧兽医研究所动物饲养室的SD小白鼠，体重25—35克，雄性，随机分成五组，即阴性对照组（丝裂霉素MMC0.25%），阳性对照组（环磷酰胺CP300%）和三个实验组（1/2 LD50，1/4 LD50，1/8 LD50，）。小白鼠按0.1ml/10g体重剂量灌胃。每组10只，每天早晨灌胃一次，连续五天，然后喂养一个月，于第三十六天处死动物，取双侧附睾，置于生理盐水中，剪碎，过滤，离心，取沉淀推片，染色镜检，每只动物检1000个精子，以千分率表示。
4、致突变性（Ames）试验
    以TA97，TA96，TA100，TA102，为测试菌株，采用Ames等建立的预培养法，实验分成不加S9，DMSO（二甲亚砜）溶剂对照组，不加S9，测试样品六个剂量组，加S9，DMSO溶剂对照组和加S9，测试样品六个剂量组及各相应的阳性对照组。37℃水浴中速振荡培养30分后，加入2ml顶层培养基，倾斜平板观察之。其中TA97+S9，TA96+S9，TA100+S9，TA102+S9，样品均用2-氨基芴2AF作阳性对照，TA97—S，采用9-氨基呷啶（9AA）TA98-89，采用2，7+二氨基芴（2，7AF），TA100—S，采用SA，TA102—S，采用甲基甲烷磺酸酯MMS作为阳性对照，代谢活化系统为多氯联苯诱导雄雌wistar大鼠后取肝脏制备S9。

三、肉鸡喂养试验及其非特异性免疫研究
1、PSB菌液应用于肉鸡
（1）试验鸡苗及分组
     由江西省农科院畜牧所提供的艾维茵肉鸡种5200羽，随机分为六组，使体重，大小基本一致，初生重抽测经方差分析，差异不显著（P>0.05）。
（2）光合细菌：由江西省宜春高新技术专利产品开发中心提供，由红假单胞菌属（Rhodo pseudomoaas）与红螺菌属（Rhodospirillaceac）的十余个菌种的混合菌群，在实验室培养，含菌数为50亿/克以上。
（3）饲料：统一饲喂同一种饲料，由江西省第一饲料厂购买。
（4）饲料方法：地面平养，干料喂养，饲喂光合细菌的组每日早上一次性地掺入饮水中投喂，其它均按常规饲养进行。
2、非特异性免疫球蛋白测定。
    于33日龄和63日龄留取鸡的血清，以醋酸纤维薄膜电泳法检测免疫球蛋白。
表一：肉鸡喂养试验小组：

试验结果

一、营养学评价结果。
1、PSBAD营养成分分析结果显示，蛋白质含量为68%，氨基酸平衡情况良好，如赖氨酸，缬氨酸，亮氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸等的百分含量均达到和超过了鸡蛋中的含量。
2、PSBAD喂养大鼠五天后，测得的蛋白质表观消化率，蛋白质净利用率分别为59.25%和52.24%。生物价达91。见表二：
表二：PSBAD的营养学评价

3、光合细菌菌体中B族维生素含量非常丰富，特别是其中维生素B12（含量达到了26μg/g），叶酸达到了（75μg/g），生物素则达到了（82μg/g），是酵母中的几十倍之多。

二、毒理学测试结果
1、大鼠急性口服毒性
    染毒二周之后，10g/kg体重灌服后未出现死亡，染毒动物的活动和食欲均未见异常，无不良反应的症状，体重正常增长，处死时对心脑肝肾肺作大体及病理检查，未见水肿及其它异常现象，据此认为，PSBAD的大鼠LD50>10g/kg。基本上是无毒的。
2、微核试验
   对骨髓嗜染红细胞微核试验镜检后，依据泊松分布作统计学检验。PSBAD的试验组P>0.05，提示PSBAD在总量分别为10克和5克的情况下，两种剂量对骨髓嗜染红细胞无明显的影响。见表三：
表三：PSBAD微核试验结果。

3、精子畸变试验结果
    精子畸变试验结果经方差分析中多个样本均数间的两两比较后，PSBAD的各个不同剂量组均与阳性对照组（环磷酰胺300%）差别有显著性（P<0.01），与阴性对照组(MMC0.25%)的差别无统计学上的意义（P>0.05）。PSBAD不同剂量组之间经统计学分析，差别亦无显著性。（P>0.05），见表四，提示测验的样品无剂量---效应关系，该物质无致畸变性。

表四：PSBAD的小鼠精子畸变试验结果。

   试验中同时对每组的畸变精子的构成也进行了分析，结果显示无钩占90%以上，胖头及香蕉形占5%左右，其它占4—5%，实验组与对照组之间畸变精子构成上差别无显著性。
4、致突变性试验Ames
   Ames试验结果提示，2AF，2，7AFK，MMS，叠氮化钠及9-氨基呷啶对TA97，TA96，TA100，TA102，均呈明显的阳性结果，而PSBAD提取液在各菌株测试中菌落数均未超过对照平皿的自发回变，即未呈致变作用，故认为PSBAD在Ames试验中均为阴性结果。
三、肉鸡喂养试验与非特异性免疫研究。
1、肉鸡喂养试验。
    六组鸡群于试验期未63日计算饲料消耗，成活率并随机抽样，测重经方差分析提示：二、三、四组与一、五、六组间差异显著（P<0.01）。二、三、四组组间和一、五、六组组间差异不显著（P>0.05）。表六：
表六：肉鸡各组主要生产性能

2、疾病发生与非特异性免疫球蛋白测定
    1到35日龄，除因弱鸡和白痢病死亡外，全部试验组生长基本正常，36日龄开始，一、五、六三组鸡群发生吃食减少，咳嗽，摇头，精神不振，个别死亡，经剖检及慢呼平板凝集反应，传支ELISA抗体检测，初步诊断为慢性呼吸道病和传染性支气管炎并发。从36到39日龄三天多时间按5%禽喘灵在饲料中拌喂，其中第五组从37日龄起同时投喂光合细菌1000ml/日组，而加喂光合细菌的二，三，四组39日龄发现个别鸡只有咳嗽，精神不振，未投药。39日龄，六个组的采食量均明显下降，这可能与当天天气骤然升温有关，因为以后采食量又马上又回升了。
    49日龄时，六个组的鸡群，普遍发生食欲减少，咳嗽，摇头，精神不振及死亡，从50日龄开始，六个组均投喂复方泰乐菌素，症状时轻时重，尤其气候变冷症状随之加重，死亡也加多，依据多次传染性支气管炎特异性抗体AbIBV与非特异性免疫球蛋白检测结果，也支持这一诊断。

表七：肉鸡AbIBV测定结果

绘成图形见下：光合细菌与疫苗对肉鸡AbIBV的影响图：
图中：①为常规+IBA疫苗。②为常规+IBA疫苗+350mlPSB/日群。③为常规+400mlPSB/日群。④为常规+700mlPSB/日群。⑤为常规+（36日龄时发病后用PSB1000ml/日群）。⑥为常规对照组（新城疫，法氏囊疫苗）。

其中：一，二组的IBV（H52）疫苗是在11日龄时，加饮水中免疫。
表8：发病前后鸡的血清中r球蛋白的含量。（%）

讨论

   由于光合细菌PSB的大规模培养技术的突破，自国内70年代起，PSB已广泛用于水产，畜牧业养殖和有机废水处理，据日本著名的营养学家金森正雄博士的研究，PSB具有完整的氨基酸构成，尤其是赖氨酸的含量极高，其蛋白质含量高达84.7%。30小时消化率达66.34%。
    对PSBAD光合细菌富集回收物的营养学研究表明：它的表观消化率为57.28%,净利用率为50.85%，生物价达89，为此认为即使当饲料蛋白来源主要取之于PSBAD，蛋白热量占10%时，PSBAD蛋白质 质量已达很高的水平了，类似于牛乳等蛋白质资源，蛋白质质量评价结果表明，PSBAD的被生物体消化的吸收情况良好，生物价达89，因此它是一种优质蛋白质资源。

我们参照中国食品毒理学评价程序和有关的饲料卫生规定，进行了符合投产前所要求的阶段毒性试验，对大鼠作经口急性毒性试验，一次性灌胃可达每公斤体重10克以上，均无死亡现象，对全部大鼠作尸解与切片检查，均未见心，脑，肝，肾，肺等部位有水肿等各种病理变化。由于LD50>10g/kg体重，提示PSBAD无体内蓄积效应，故直接进入第二阶段试验，试验结果显示：①Ames试验中，PSBAD对TA97，TA96，TA100，TA102，均无致突变作用，而对照组均呈现阳性结果，由于Ames试验的筛选作用，因而初步认为PSBAD无明显致突变影响。②精子畸变试验同样在与对照组的比较中，未发现PSBAD有明显的致畸影响。畸变数为19.33%--28.00%，与生物本底畸变无显著性差别。③微核试验也表明PSBAD在1g/kg体重---2g/kg体重时，也同样表明呈阴性结果。因而，经过二阶段多种测试指标的考核，我们有理由认为PSBAD没有明显的致畸与致突变影响，依据国家现有卫生标准与规定，通过市场信息的反馈和继续进行安全性评价以追踪其有无必要进行第三阶段即慢性毒理学试验，为保障人民健康和产品信誉提供依据。

毒理学结果同时表明，以往认为许多单细胞蛋白中RNA浓度过高，从理论上讲可能是有潜在的危害，但本试验中尚未发现食用光合细菌单细胞蛋白PSBAD的动物组织有水肿等病变，这一方面提示PSBAD可能是在代谢上与其它单细胞蛋白的不同，另一方面在于PSBAD添加量较少即可产生生物活性作用，就是作为蛋白饲料添加量一般宜小于5%，因此RNA的浓度也不可能高，这提高了安全性。

在肉鸡饲养结果中：从1日龄起添加PSB的三组和没添加PSB的三组，这两大组之间的体重差别有显著性(P<0.01)，这表明PSB与肉鸡的生长速度存在关联性，前后两大组组内间的体重差别不显著(P>0.05)，表明均衡了PSB的因素后，鸡群的生长情况一致，由此鸡群中进行试验，考核了PSB的作用是具备实验条件的。此外，36日龄起，部分鸡发生呼吸道感染疾病，在未加PSB组中发生率大大高于添加了PSB组，且后者发病时间较晚，症状较轻，愈后较快，表明PSB具有增加抵抗力的作用，更具有意义的是，发病后追加PSB也同样显示出抗病作用。综合以上三方面情况，最终结果显示，添中PSB组比未加PSB鸡群平均增重180克，料肉比减少0.5，扣除发病后不用药或减少用药的潜能，PSB添加可增加毛利60%。曾报道，日本的VS科工PSB产品应用于蛋鸡和我们以往PSB在蛋鸡试验中的结果与本试验结果基本吻合。

在肉鸡试验中，分别于33日龄和63日龄提取血清，测定R球蛋白，结果发现：PSB组与发病后追加PSB组的R球蛋白平均含量在发病后达19.50%，明显高于未加PSB组的10.10%，提示了以上关于PSB与疾病发生和恢复的关联性，曾有许多科学工作者对PSB菌体分子结构进行了深入的研究，PSB属于G—细菌，其含多糖体及其它活性结构，具有较强的抗原性，合成大量常规饲料中缺乏的叶酸，泛酸和其它B族维生素物质。为此，给PSB作为饲料添加剂，增加动物机体的免疫力提供了理论上的依据。