强微乳酸粪肠球菌对酸碱度的耐受性试验研究报告
江西农业大学江西省高校动物营养重点实验室 南昌瞿明仁 330045
宜春强微生物科技有限公司 宜春钟启平 336000
笔者注：本试验是探讨强微复合菌中的乳酸菌部分，对酸碱度的耐受性试验，是强微公司与江西农大协同创新产学研合作项目之一。
摘要：随着国家对动物饲料中添加药的规范，以及烈性传染性疾病的减少，饲料中添加药物越来越少，为微生态制剂的应用提供了应用前景。为此，本文对宜春强微生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用进行了研究。
乳酸粪肠球菌是一种微生态制剂，主要成分是可与动物共生的有益微生物群，对于改善动物胃肠功能，促进生长和提高生产性能具有明显的功能。在生产实践中使用普遍或滥用抗生素及兽药，耐药性问题、兽药残留问题直接影响着我国动物性食品的质量，也影响了生微生态制剂在生产中的应用。因此国家对动物饲料中添加药的控制也越来越严格，因此，研究、开发及应用新型微生态制剂是今后发展的方向，为此，笔者对宜春强微生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌进行了对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用研究，预期为微生态制剂在饲料中应用提供理论基础。
其中在不同pH环境中耐受性试验表明，该乳酸粪肠球菌对酸性环境相对耐受性较强，但在长时间作用下，存活率较低，在碱性条件下也有较好的存活率，表明该乳酸粪肠球菌可以在PH2～10的范围内存在活性，其中PH=2时，处理30分钟存活率达93.38%，处理120分钟时达59.93%，PH=10时，处理30分钟存活率达57.84%，而处理120分钟时达33.66%，考虑到乳酸菌的脆弱性，试验表明强微乳酸粪肠球菌对PH的适应范围达2-10，生存能力在乳酸菌中是非常强的。
本文为乳酸粪肠球菌酸碱度的耐受性试验结果
1. 材料与方法
1.1、材料
1.1.1、药物及主要试剂：无菌生理盐水、1mol/L NaOH溶液由实验室自行配制；盐酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶购自长城生物公司。
1.1.2、培养基：LB培养基、HM（Mueller-Hinton）培养基，购自长城生物公司。
1.1.3、参照菌株：乳酸粪肠球菌标准菌株ATCC 29212；质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 25923，购自南昌市长城生物有限公司。
1.1.4、试验对象：乳酸粪肠球菌，由宜春强微生物科技有限公司提供。
1.2、方法：
1.2.1、不同pH值处理对乳酸粪肠球菌存活率的影响试验
取10g乳酸粪肠球菌分别加入用1mol/L NaOH调整pH=2.0、3.0、4.0、5.0、8.0、9.0、10.0的90mL生理盐水中，混匀于室温中分别处理30min、60min、90min、120min。
处理后溶液用无菌生理盐水做10-1、10-2、10-3……10倍递度稀释，在10-5~10-6两个稀释度各取0.1mL，加入无菌平皿；同时取未经pH处理的乳酸粪肠球菌也做10倍递度稀释，取10-5~10-6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50℃的MH培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37℃恒温培养24小时，观察并记数。以上样品均重复3次以上，以平均数为准。
存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100。
2、结果
2.1、不同pH值处理对乳酸粪肠球菌存活率影响试验结果
乳酸粪肠球菌在不同pH条件下，具有不同的耐受性，对酸性受性更强，对碱性，尤其是强碱（pH＝10）时，耐受性较差。随着时间延长，到120min时，耐受性明显下降。具体见表1、表2、图1、图2。
从表1、表2、图1、图2可见，不同PH处理30min后，以PH=10影响最大，菌数最低，其它六种PH均相差不大。处理60min后，仍是PH=10时菌数下降最明显，但其它六种情况也出现分化，PH=2和PH=9两种情况下降明显，其它四种PH处理菌数下降相对平缓。处理90min后，前六种PH处理菌数又趋于接近， PH=10处理后菌数也趋平缓。但到120min后，又是一个明显的下降，但下降幅度不同PH不同，以PH10、PH4、PH5三种PH环境处理菌数最低，而另四种PH环境处理相对好一些。总之，该乳酸粪肠球菌在PH=10环境中，生存能力最差，而在其它六种环境中，90min内比较接近。考虑到乳酸菌本身的脆弱性，本次试验结果表明，强微乳酸粪肠球菌的耐酸性是极强的，能在极端PH环境中生存。
表1：不同PH值处理后乳酸粪肠球菌计数结果(单位: ×1010 CFU/g)
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处理时间
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30 min
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60 min
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90 min
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120 min
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pH值
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2.0
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1.34 ± 0.25
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0.91 ± 0.11
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0.89 ± 0.09
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0.86 ± 0.16
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3.0
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1.31 ± 0.34
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1.20 ± 0.31
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1.08 ± 0.08
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1.00 ± 0.08
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4.0
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1.18 ± 0.17
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1.13 ± 0.37
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0.97 ± 0.11
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0.53 ± 0.04
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5.0
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1.12 ± 0.27
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0.99 ± 0.09
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0.98 ± 0.06
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0.63 ± 0.15
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8.0
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1.27 ± 0.07
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1.23 ± 0.13
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1.06 ± 0.52
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0.88 ± 0.07
|
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9.0
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1.33 ± 0.08
|
0.95 ± 0.06
|
0.93 ± 0.02
|
0.85 ± 0.07
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10.0
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0.83 ± 0.03
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0.59 ± 0.13
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0.58 ± 0.01
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0.48 ± 0.13
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注：未处理乳酸粪肠球菌计数=1.43×1010 CFU/g
表2：不同PH值处理后乳酸粪肠球菌存活率
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处理时间
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30 min
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60 min
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90 min
|
120 min
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pH值
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2.0
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(93.38±17.42)%
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(63.62±7.67)%
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(62.02±6.27)%
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(59.93±11.15)%
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3.0
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(91.08±23.69)%
|
(83.62±21.60)%
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(75.05±5.57)%
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(69.69±5.57)%
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4.0
|
(82.02±11.85)%
|
(78.75±25.78)%
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(67.46±7.67)%
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(36.72±2.79)%
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5.0
|
(77.91±18.82)%
|
(68.99±6.27)%
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(68.50±4.18)%
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(44.13±10.45)%
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8.0
|
(88.71±4.88)%
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(85.92±9.06)%
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(73.87±9.06)%
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(61.53±4.88)%
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9.0
|
(92.89±9.06)%
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(65.99±4.18)%
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(64.67±1.39)%
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((58.89±4.88)%
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10.0
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(57.84±2.09)%
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(40.91±4.88)%
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(40.21±0.70)%
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(33.66±9.06)%
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图9：不同pH条件下，乳酸粪肠球菌耐性试验结果图
图10：不同pH条件下，乳酸粪肠球菌的存活率变化图
3：小结与讨论
3.1、乳酸粪肠球菌在不同pH条件下，具有不同的耐受性，没有明显的规律。总体来看是对酸性受性更强，对碱性，尤其是强碱（pH＝10）时，耐受性较差。
不同PH处理30min后，以PH=10影响最大，乳酸粪肠球菌存活率最低，其它六种PH均相差不大。处理60min后，仍是PH=10时菌数下降最明显，但其它六种情况也出现分化，PH=2和PH=9两种情况下降明显，其它四种PH处理菌数下降相对平缓。处理90min后，前六种PH处理菌数又趋于接近，PH=10处理后菌数也趋平缓。但到120min后，又是一个明显的下降，但PH不同下降幅度不同，以PH10、PH4、PH5三种PH环境处理乳酸粪肠球菌存活率最低，另四种PH环境处理相对好一些。总之，该乳酸粪肠球菌在PH=10环境中，生存耐受能力最差，而在其它六种环境中，90min内比较接近，随着时间延长，到120min时，耐受性均明显下降。
考虑到乳酸菌本身的脆弱性，本次试验结果表明，强微乳酸粪肠球菌的耐酸性是极强的，能在极端PH环境中生存。
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