强微乳酸粪肠球菌对胆盐和胃液及肠液的耐受性试验研究报告
江西农业大学江西省高校动物营养重点实验室 南昌瞿明仁 330045
宜春强微生物科技有限公司 宜春钟启平 336000
笔者注：本试验是探讨强微复合菌中的乳酸菌部分，对胆盐和胃肠液的耐受性试验，是强微公司与江西农大协同创新产学研合作项目之一。
摘要：随着国家对动物饲料中添加药的规范，以及烈性传染性疾病的减少，饲料中添加药物越来越少，为微生态制剂的应用提供了应用前景。为此，本文对宜春强微生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用进行了研究。
乳酸粪肠球菌是一种微生态制剂，主要成分是可与动物共生的有益微生物群，对于改善动物胃肠功能，促进生长和提高生产性能具有明显的功能。在生产实践中使用普遍或滥用抗生素及兽药，耐药性问题、兽药残留问题直接影响着我国动物性食品的质量，也影响了生微生态制剂在生产中的应用。因此国家对动物饲料中添加药的控制也越来越严格，因此，研究、开发及应用新型微生态制剂是今后发展的方向，为此，笔者对宜春强微生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌进行了对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用研究，预期为微生态制剂在饲料中应用提供理论基础。
对胆盐的耐受能力不同浓度相差不大，但随处理时间延长，存活率明显下降；在处理3小时后，存活下降到40%。
乳酸粪肠球菌对牛瘤胃酸性耐受较强，尤其是对天然牛瘤胃液耐受性强，处理5小时后，仍有近70%的存活率；对人工胃液耐受性相对低一些，2小时后，存活率为60%左右，但处理5小时后，存活率降至28%。
本文为乳酸粪肠球菌对胆盐和胃液及肠液的耐受性试验结果。
1. 材料与方法
1.1、材料
1.1.1、药物及主要试剂：无菌生理盐水、1mol/L NaOH溶液由实验室自行配制；盐酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶购自长城生物公司。
1.1.2、培养基：LB培养基、HM（Mueller-Hinton）培养基，购自长城生物公司。
1.1.3、参照菌株：乳酸粪肠球菌标准菌株ATCC 29212；质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 25923，购自南昌市长城生物有限公司。
1.1.4、试验对象：乳酸粪肠球菌，由宜春强微生物科技有限公司提供。
1.2、方法：
1.2.1、不同胆盐处理对乳酸粪肠球菌存活率的影响
取1g乳酸粪肠球菌分别加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的胆盐溶液各9mL，混匀于室温中分别处理30min、1h、2h、3h。
处理后溶液用无菌生理盐水做10-1、10-2、10-3……10倍递度稀释，在10-5~10-6两个稀释度各取0.1mL，加入无菌平皿；同时取未经胆盐处理的乳酸粪肠球菌也做10倍递度稀释，取10-5~10-6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50℃的MH培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37℃恒温培养24小时，观察并记数。以上样品均重复两次以上，以平均数为准。
乳酸粪肠球菌存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100。
1.2.2、乳酸粪肠球菌对胃液的敏感性实验
取1g乳酸粪肠球菌分别加入人工胃液、牛胃液各9mL，混匀于室温中分别处理于1h、2h、3h、4h、5h。
处理后溶液用无菌生理盐水做10-1、10-2、10-3……10倍递度稀释，在10-5~10-6两个稀释度各取0.1mL，加入无菌平皿；同时取未经胃液处理的乳酸粪肠球菌也做10倍递度稀释，取10-5~10-6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50℃的MH培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37℃恒温培养24小时，观察并记数。以上样品均重复两次以上，以平均数为准。
乳酸粪肠球菌存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100。
1.2.3、乳酸粪肠球菌对肠液的敏感性实验
取1g乳酸粪肠球菌加入肠液各9mL，混匀于室温中分别处理于2h、4h、6h、8h、10h。
处理后溶液用无菌生理盐水做10-1、10-2、10-3……10倍递度稀释，在10-5~10-6两个稀释度各取0.1mL，加入无菌平皿；同时取未经肠液处理的乳酸粪肠球菌也做10倍递度稀释，取10-5~10-6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50℃的MH培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37℃恒温培养24小时，观察并记数。以上样品均重复两次以上，以平均数为准。
乳酸粪肠球菌存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100。
2、结果
2.1、不同胆盐处理对乳酸粪肠球菌存活率影响试验结果
从图表中可见，乳酸粪肠球菌在胆盐处理后，随时间延长，菌数均呈下降趋势；而不同浓度来看，随着胆盐浓度上升，菌数基本是遵循胆盐浓度越高，菌数越低的规律。从图可见，在30min内，存活均比较高；在1-2小时是一个明显的变化阶段，到第3小时后，四个不同的胆盐浓度下，菌均下降明显，而且菌落比较接近。具体试验结果见表1、表2和图1、图2。
表1：胆盐处理后，乳酸粪肠球菌计数结果(单位: ×1010 CFU/g)
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胆盐浓度
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0.2%
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0.3%
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0.4%
|
0.5%
|
|
处
理
时
间
|
0.5 h
|
1.96 ± 0.09
|
1.89 ± 0.07
|
1.84 ± 0.08
|
1.73 ± 0.12
|
|
1 h
|
1.72 ± 0.03
|
1.67 ± 0.14
|
1.66 ± 0.29
|
1.35 ± 0.15
|
|
2 h
|
1.50 ± 0.08
|
1.52 ± 0.06
|
1.37 ± 0.10
|
0.95 ± 0.19
|
|
3 h
|
0.72 ± 0.18
|
0.71 ± 0.05
|
0.58 ± 0.05
|
0.54 ± 0.12
|
注：未处理乳酸粪肠球菌计数=2.01×1010 CFU/g
表2：胆盐处理后，乳酸粪肠球菌存活率
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胆盐浓度
|
0.2%
|
0.3%
|
0.4%
|
0.5%
|
|
处
理
时
间
|
0.5 h
|
（97.51±4.48）%
|
（94.03±3.48）%
|
（91.54±3.98）%
|
（86.07±5.97）%
|
|
1 h
|
（85.57±1.49）%
|
（83.08±6.97）%
|
（82.59±14.43）%
|
（67.16±7.46）%
|
|
2 h
|
（74.63±3.98）%
|
（75.62±2.99）%
|
（68.16±4.98）%
|
（47.26±9.45）%
|
|
3 h
|
（35.82±8.96）%
|
（35.32±2.49）%
|
（28.86±2.49）%
|
（26.87±5.97）%
|
图1：不同浓度胆盐处理后，菌数变化图
图2：不同浓度胆盐处理后，乳酸粪肠球菌存活率变化图
2.2、乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液、人工胃液的敏感性试验结果
从表3、图4、表3、图4可见，乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液耐受性比较强，通过天然牛瘤胃液处理3小时，存活仍有95%以上，到第5小时仍有66.5%的菌存活。而对人工胃液的耐受性明显下降，经人工胃液处理1小时，存活率就下降到81%；第2小时，存活率就仅有61左右；第3小时后，又有近一半死亡，存活率仅37.93%；第4小时后，存活率不到30%。
表3：乳酸粪肠球菌耐天然牛瘤胃液试验结果
|
牛瘤胃液处理时间
|
0 h
|
1 h
|
2 h
|
3 h
|
4 h
|
5 h
|
|
乳酸粪肠球菌活菌含量
（×1010CFU/g）
|
2.03±0.06
|
2.01 ± 0.32
|
1.95 ± 0.28
|
1.93 ± 0.08
|
1.48 ± 0.06
|
1.35 ± 0.70
|
|
乳酸粪肠球菌存活率（%）
|
100±2.96
|
99.01±15.76
|
96.06±13.93
|
95.07±3.94
|
72.91±2.96
|
66.5±0.34
|
表4：乳酸粪肠球菌耐人工胃液试验结果
|
人工胃液处理时间
|
0 h
|
1 h
|
2 h
|
3 h
|
4 h
|
5 h
|
|
乳酸粪肠球菌活菌含量
（×1010CFU/g）
|
2.03 ± 0.06
|
1.66 ± 0.21
|
1.25 ± 0.07
|
0.77 ± 0.12
|
0.59 ± 0.14
|
0.57 ± 0.07
|
|
乳酸粪肠球菌存活率（%）
|
100±2.96
|
81.77±2.99
|
61.58±3.45
|
37.93±5.91
|
29.06±6.90
|
28.08±3.45
|
图3：乳酸粪肠球菌在天然牛瘤胃液和人工胃液中存活率变化图
2.3、乳酸粪肠球菌对人工肠液的敏感性试验结果
结果显示，乳酸粪肠球菌对人工肠液有一定的耐受性。在2小时内，存活率达98.16%；4小时后存活率仍有72.64%。但到第6小时后，存活率明显下降，不到50%，到第8小时降到40%以下，10小时后，则降到30%以下。具体结果见表5、图5。
表5：乳酸粪肠球菌耐人工肠液试验结果
|
肠液处理时间
|
0 h
|
2 h
|
4 h
|
6 h
|
8 h
|
10 h
|
|
乳酸粪肠球菌活菌含量
（×109CFU/g）
|
4.35±0.07
|
4.27±0.60
|
3.16±0.33
|
2.10±0.06
|
1.73±0.09
|
1.26±0.08
|
|
乳酸粪肠球菌存活率（%）
|
100±1.61
|
98.16±13.79
|
72.64±7.59
|
48.28±2.96
|
39.77±4.43
|
28.97±3.94
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图5：乳酸粪肠球菌在人工肠液不同时间处理后的存活率变化图
3：小结与讨论
3.1、本菌对胆盐的耐受能力与不同胆盐浓度处理结果生存率相差不大，尤其是0.2%、0.3%、0.4%、三个胆盐浓度处理后，差异不显著；0.5%胆盐浓度处理后，有一定的差异。但与处理时间密切相关，即处理时间越长，存活率下降明显。在处理3小时后，存活均不到40%，考虑到乳酸菌的脆弱性，本试验结果表明，本试验乳酸粪肠球菌对胆盐的耐受能力很强。
3.2、在对胃液敏感性试验中发现，乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液耐受性比较强，通过天然牛瘤胃液处理3小时，存活仍有95%以上，到第5小时仍有66.5%的菌存活。而对人工胃液的耐受性明显下降，经人工胃液处理1小时，存活率就下降到81%；第2小时，存活率就仅有61左右；第3小时后，又有近一半死亡，存活率仅37.93%；第4小时后，存活率不到30%，在乳酸菌中，这个存活率是比较高的。
分析其原因可能与人工胃液是模真胃环境有关，在真胃环境中，胃酸浓度高，对乳酸粪肠球菌杀伤作用强；而在天然牛瘤胃液中，PH在中性，所以乳酸粪肠球菌存活率高。
3.3、本试验结果发现，乳酸粪肠球菌对人工肠液的耐受性在4小时内比较强，与天然牛瘤胃液类似：处理2小时存活率98.16%，处理4小时后，存活率72.64%。而在4小时以上时，存活率就比较低，第6小时存活率48.28%，第10小时存活率仅28%，但很显然，本试验乳酸粪肠球菌在肠液中具有较强的生存率。
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