本文发表在《畜禽业》杂志1999年第10期上
宜春强微高新技术专利产品开发中心 钟启平
宜春强微生物科技有限公司
3.1 菌种生产工艺条件
即培养基配方及培养环境条件,这是首先应考虑到的,微生物的污染是防不胜防的,尽管有最先进的设备,也不能绝对防止它进入培养料中,所以制定一个具有高度选择性的生产工艺条件是上策,更何况我们都习惯于那些比较粗放的简单的生产方式。
3.1.1 配方:生产中切忌采用营养过于丰富的或碳氮比极高的培养基配方,在二,三,四级种子阶段采用具有驯导作用的配方是很有效的,例如在以菜粕为主原料的固态发酵生产中,在种子配方中可采用在二,三,四级种子培养基配方中逐步放大菜粕用量的方法,同时配合其它配方技术,既可有效地防止杂菌污染,又可得到较高的细胞含量。同时,种子也得到了三步驯导,有利于发酵生产。
过于丰富的培养基的第一个弊端在于细胞生长过旺过快,加上空气中热量的扩散速度跟不上,使物料内部产生高温可达50度和缺氧环境,使厌气性高温杆菌和球菌大量繁殖,产生不良气味,其次,在湿度较高的底部会生长成片的黑根霉菌块。笔者认为,以油料饼粕,淀粉质原料复配,使基料蛋白质含量在25—35%之间为宜,同时加入1.5—5%的无机盐(根据本厂菌种渗透压耐性而定),来调节渗透压,抑制杂菌生长,必要时加入盐酸溶液以调节PH值到5左右。
3.1.2 物料水分和环境湿度: 水分对微生物来说有非常重要的意义,各种营养成分必须先溶解于水中,才能被细胞利用。需水量的多少,随着微生物的种类而不同,一般来说水分的需要程度是:细菌>酵母>霉菌。保持环境的相对湿度也是很重要的,基质中的水分,特别是表面部分的含水量,随空气中的湿度变化而呈现正相关变化。与微生物的发育有密切关系的,不是绝对水分含量%,而是水分活性(简写为AW),基质中含的水分不能全部为微生物所利用,其中的一部分得溶解基质的成分,因此与可溶性物质少的基质相比,可溶性物质多的基质水分活性就低,微生物的繁殖就相对地不容易。可溶性物质一旦溶于水,水的一部分就捕获这种物质,水的蒸汽压就会降低。假如纯水的水蒸汽压为P0(25℃),基质中水的蒸汽压为P,则这种基质的水分活性就为AW=P/P0。
控制基质AW对于控制根霉的污染具有很重要的意义,主发酵酵母菌往往是耐高渗的,所以有意识地在基料中复配一定的无机盐类,适度地降低水分活性,提高水中的渗透压,可有效地抑制根霉菌的生长,同时又可使基质保持的绝对含水量,并且不会在培养过程中较快的干涸。另一方面,在后序的生产发酵中,往往加水比仅为:1︰0.52—0.62,水活性AW更低,故而在三,四级种子的培养料中加入适当的无机盐类,更有驯导的作用,大大缩短发酵延滞期。
从表2,表3中可知,黑根霉较容易控制并有效地抑制其生长。但对好氧条件下的葡萄球菌来说,其对AW的要求接近于曲霉菌,某些葡萄球菌甚至于可耐0.82以下的水活性。它们会在种子扩大培养中累积生长并潜伏下来,在连续通风发酵生产中,表现出较强的污染性。
表2:某些盐类饱和溶液所显示的水分活性(25℃)和普通微生物发育的最低水分活性AW
盐类 AW 盐类 AW |
微生物 发育的最低AW |
KCl 0.842 K2C2O7 0.980
NaCl 0.752 KNO3 0.924
KBr 0.807 BaCl2 0.901
MgCl2 0.330 SrCl 0.708
NaNO3 0.737 Mg(NO3)2 0.528
K2CO3 0.427 K(C2H3O2) 0.224 |
普通细菌 0.90
普通酵母 0.88
普通霉菌 0.80
好盐细菌 0.75以下
耐干渗霉菌 0.65
耐渗酵母 0.61 |
表3:一些生产用菌及污染微生物的发育及最低AW的关系
微生物 发育最低AW |
微生物 发育最低AW |
肉毒杆菌 0.98
蜡样芽孢杆菌 0.97
沙门氏菌 0.95
绿脓极毛杆菌 0.94
黑根霉 0.93
大肠杆菌 0.92
八叠球菌属 0.91 |
玫瑰式小球菌 0.90
嫌气金黄色葡萄球菌 0.90
好气金黄色葡萄球菌 0.87
黑曲霉 0.86
灰绿曲霉 0.81
扣囊拟内孢霉 0.769
白地霉 0.842 |
空气中湿度以70—80%为宜,过高易滋生霉菌,细菌。过低则基质水分散失过多过快,不利于种子生长。
3.1.3 温度与供气: 料温不得高于40度,否则杆状细菌会大量繁殖,持续高温会使种子过早衰老死亡,得到的种子质量活力不高,发酵的延滞期较长。料温最好控制在30度左右,对于5公分厚的三级种子浅盘培养而言,宜在培养10小时后,切断培养室内的热源,仅靠料温或种子本身生长产热来维持培养室内的温度恒定,22小时可培养成熟出料,该法是针对密封性较好的培养室而言的,夏天则应注意降温,对于培养量较大的四级种子生产,则空间应注意通风换气,以易于控制温湿度为宜。
3.1.4 酸碱度: 微生物的生长繁殖受环境酸碱度PH值的影响,与温度条件一样,各种微生物有自己适宜的PH范围。一般说来,细菌,尤其是有害细菌的最适PH范围是中性偏碱性(PH=7--8),大多数的酵母和霉菌生长的最适PH范围是弱酸性(PH=4--6),与细菌相比,霉菌和酵母生长的PH范围较广一些。微生物在超过其PH的最适范围外的环境中,生长便受到抑制,甚至发育受阻,因此,控制基质的PH值,就可以控制微生物的繁殖和活动,例如调节基料的PH在4.0—5.5之间,可控制且遏止有害细菌的生长,而不影响酵母和霉菌的生长。
另外有些发酵设施也可采用酸处理的方法来预防杂菌的生长,如湖南省有家私营企业,采用竹扁上竹架的大规模发酵生产酶制剂产品,日产500公斤,年创利80多万元,但细菌产氨味问题一直没有得到很好的解决。尽管采用了各种遏止方法都无济于事,成为数年来的一块心病,后来发现,是由于竹扁太多,劳动强度太大,在清洗和消毒竹扁时,不能完全杀死竹扁上的残留的细菌。既然无法全部都杀死,则最好的方法是抑制它的生长,于是在竹扁清洗后,用1%的盐酸溶液配合消毒水对竹扁进行喷雾处理,晒干后再用于发酵,就从根本上解决了长时间发酵(72小时),隐藏的产氨问题。
以上各种工艺条件对制种来讲,应是相辅相成,总之,各种微生物都有自己最适宜的生长条件。因此只要我们有目的地控制这些条件,人为地破坏杂菌的生长条件,就可以防止或减少杂菌的污染。
3.2 加强原料管理,车间合理布置,严格灭菌操作。
黑根霉等来源于各类型的原料,必须加强原料管理。原料必须严格灭菌才能进行制种,原料配合和预处理车间必须远离或隔离于制种车间,杜绝一切使原料在车间内频繁搬运的操作,不使用发霉结块和变质的原料,使用的水要干净清洁。
3.3 注意环境卫生及个人卫生
充实必要的自动化设备,尽量做到不用手工操作,墙壁天花板的涂料中应配合高效低毒的防霉剂以防止发霉;建立工作服的清洁卫生和消毒灭菌制度。对于无菌室,菌种室及培养室,则要建立定期的空间,地面等消毒灭菌制度。
注意车间的通风,除尘,干燥和消毒,尽可能减少和杜绝微生物的污染源。
实验的操作后,要及时地处理现场,尤其是残留培养基和残留菌种,要及时地进行清洗和灭菌处理。
在抓好管理的同时,要对职工经常进行培训,培养无菌意识,建立无菌概念,有效地防止杂菌污染。
全文完