饲料制粒对乳酸粪肠球菌复合制剂存活率影响试验报告
（江西农业大学江西省高校动物营养重点实验室 南昌 330045）
（宜春强微生物科技有限公司 宜春 336000）
笔者注：本试验是探讨强微复合菌中的乳酸菌部分，对饲料制粒的耐受性试验，是强微公司与江西农大协同创新产学研合作项目之一。
摘 要：为了解饲料制粒对乳酸粪肠球菌复合制剂存活率影响，试验设计10-2、10-3、10-4、10-5等4个稀释倍数，采用MH培养和平皿活菌计数法测定雏鹅和成鹅配合饲料制粒前后乳酸粪肠球菌复合制剂存活率。结果表明：雏鹅饲料制粒后乳酸粪肠球菌复合制剂存活率为73.28%（制粒条件78～85℃，调质3分钟）；成鹅饲料制粒后乳酸粪肠球菌复合制剂存活率为14.07%（制粒条件90～95℃，调质3分钟）。表明乳酸粪肠球菌复合制剂经过制粒后，随着制粒条件的不同，对其存活率的影响有显著的差别，尤其是成鹅饲料中存活率显著降低，但在雏鹅颗粒饲料制粒条件下，乳酸粪肠球菌具有极高的存活率，具有实用性价值。
关键词：乳酸粪肠球菌复合制剂；饲料制粒；存活率
1、材料
1.1 乳酸粪肠球菌复合制剂
由宜春强微公司生产，主要由乳酸粪肠球菌、酵母菌、芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成，添加量为150克/吨。
1.2 鹅配合饲料制粒
鹅配合饲料制粒在江西格力特饲料有限公司进行。
制粒条件：雏鹅颗粒饲料制粒条件78～85℃，调质3分钟；成鹅制粒条件90～95℃，调质3分钟，水份15%。
1.3 培养基
MH培养基、琼脂粉，购自长城生物公司；0.9%NaCl生理盐水，由本实验室自行配制，121℃高压灭菌30min，室温备用。
1.4 主要设备
电热恒温培养箱，高压蒸汽灭菌器，微量移液器等
2、方法：采用常规平皿活菌计数法。
2.1 样品稀释：每个样品准备6支中号预先高压灭菌的试管于试管架上，每支试管加入无菌生理盐水4.5ml备用。
再将样品均匀碾碎，取0.5g碾碎的样品，放入上述加有4.5ml无菌生盐水的第一支试管中，混匀；然后取出0.5ml置于第二支试管，混匀。以此例推，稀释到第五支试管，5支试管的样品稀释度分别为：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2.2 制作平板： 在10-2~10-5四个稀释度各取0.1mL，加入无菌平皿，将溶化后冷却至50℃的MH培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37℃恒温培养24小时，观察并记数。每个稀释度做两次，以平均数计算结果。
2.3 菌落计数及判别标准
依据稀释度，根据以下标准进行判断。试验中，只取0.1mL做稀释，所以每mL计数结果，应等于平均菌落数×稀释度×10。
2.3.1 如只有一个稀释度平均菌落数在30~300之间，则以此稀释度作为试验结果计数；
2.3.2 如有两个相邻稀释度菌落平均数均在30~300之间，则计算二个菌落平均数的比值。如比值＜2，则应报告两个稀释计的平均菌落数；如比值＞2，则应报告两个稀释度中较大菌落数；
2.3.3 如所有稀释度平均菌落数都大于300，则按最高稀释度的平均菌落数计算；
2.3.4 如所有稀释度平均菌落数都小于30，则按最低稀释度平均菌落数计算；
2.3.5 如所有稀释度均不在30~300之间，有大于300的，也有小于30的，则以最接近30或300的平均菌落数计算。
2.3.6 如所有稀释度均未见菌落生长，则应报告结果小于10，而不是0。
2.4 乳酸粪肠球菌复合制剂制粒前、后存活率计算：
乳酸粪肠球菌复合制剂存活率＝制粒后菌落总数/制前菌落总数×100%。
3、结果
3.1、雏鹅饲料制粒前、后乳酸粪肠球菌复合制剂菌落数及存活率
雏鹅饲料制粒前、后乳酸粪肠球菌复合制剂菌落数测定数据见表1。
表1 雏鹅配合饲料制粒前、后乳酸粪肠球菌复合制剂菌落数（CFU/g）
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稀释倍数
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10-3
|
10-4
|
10-5
|
10-6
|
|
制粒前
|
第1次
|
361
|
39
|
3
|
0
|
|
第2次
|
397
|
47
|
0
|
0
|
|
平均数
|
379±25.5
|
43±5.7
|
1.5±2.1
|
0
|
|
颗粒料
|
第1次
|
242
|
31
|
2
|
0
|
|
第2次
|
260
|
32
|
5
|
0
|
|
平均数
|
251±12.7
|
31.5±0.7
|
3.5±2.1
|
0
|
依据判断标准，制粒前样品只有在稀释倍数为10-4时菌落数在30~300之间，所以选择该稀释度为计数结果，即制粒前活菌数＝（43.0±5.7）×104 CFU/g；制粒后样品也是在在稀释倍数为10-4时菌落数在30~300之间，所以选择该稀释度为计数结果，即制粒后活菌数＝（31.5±0.7）×104 CFU/g；据此计算雏鹅饲料制粒前、后乳酸粪肠球菌复合制剂存活率＝73.28%。
3.2、成鹅饲料制粒前、后乳酸粪肠球菌复合制剂菌落数及存活率
成鹅饲料制粒前、后乳酸粪肠球菌复合制剂菌落数及存活率测定结果见表2。
表2：成鹅配合饲料制粒前、后乳酸粪肠球菌复合制剂菌落数（CFU/mL）
|
稀释倍数
|
10-3
|
10-4
|
10-5
|
10-6
|
|
制粒前
|
第1次
|
375
|
65
|
1
|
0
|
|
第2次
|
436
|
75
|
0
|
0
|
|
平均数
|
405.5±43.1
|
70±0.7
|
0.5±0.7
|
0
|
|
颗粒料
|
第1次
|
87
|
15
|
0
|
0
|
|
第2次
|
110
|
13
|
0
|
0
|
|
平均数
|
98.5±16.3
|
14±1.4
|
0
|
0
|
依据判断标准，制粒前只有在稀释倍数为10-4时菌落数在30~300之间，所以选择该稀释度为计数结果，即制粒前活菌数＝（70.0±0.7）×104 （CFU/g）；制粒后只有在稀释倍数为10-3时菌落数在30~300之间，所以选择该稀释度为计数结果，即制粒后活菌数＝（98.5±16.3）×103 （CFU/mL）；益生菌存活率＝14.07%。
4、小结
雏鹅饲料制粒后乳酸粪肠球菌复合制剂存活率为73.28%（制粒条件78～85℃，调质3分钟）；成鹅饲料制粒后乳酸粪肠球菌复合制剂存活率为14.07%（制粒条件90～95℃，调质3分钟）。表明乳酸粪肠球菌复合制剂经过制粒后，随着制粒条件的不同，对其存活率的影响有显著的差别，尤其是成鹅饲料中存活率显著降低，但在雏鹅颗粒饲料制粒条件下，具有极高的存活率，具有实用性价值。
分析：雏鹅饲料中由于大多原料均已是熟化原料，所以，对制粒的温度要求不高，调质时间要求也不高，所以，乳酸粪肠球菌的存活率水平比较高。而成鹅饲料由于饲料多为生料，以及粗纤维含量，所以，要求的制粒温度和调质时间比较高和长，所以，存活率相对低一些；
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