强微乳酸粪肠球菌对抗生素耐受性试验研究报告
江西农业大学江西省高校动物营养重点实验室     南昌 瞿明仁  330045
宜春强微生物科技有限公司      宜春 钟启平   336000

     笔者注：本试验是探讨强微复合菌中的乳酸菌部分，对常规抗生素的耐受性试验，是强微公司与江西农大协同创新产学研合作项目之一。
       摘要：随着国家对动物饲料中添加药的规范，以及烈性传染性疾病的减少，饲料中添加药物越来越少，为微生态制剂的应用提供了应用前景。为此，本文对宜春强微生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用进行了研究。
      结果发现乳酸粪肠球菌对饲料中国家允许添加的7种常规药物有不同程度的耐受性：其中对阿散酸的耐受性最强、其次为杆菌肽锌；对金霉素、喹乙醇、硫酸粘杆菌的耐受性均在国家规定添加量以上；但也发现对吉他霉素、盐霉素的耐性较差。试验还表明该乳酸粪肠球菌对大肠杆菌有较强的抑菌作用。
      乳酸粪肠球菌是一种微生态制剂，主要成分是可与动物共生的有益微生物群，对于改善动物胃肠功能，促进生长和提高生产性能具有明显的功能。在生产实践中使用普遍或滥用抗生素及兽药，耐药性问题、兽药残留问题直接影响着我国动物性食品的质量，也影响了生微生态制剂在生产中的应用。因此国家对动物饲料中添加药的控制也越来越严格，因此，研究、开发及应用新型微生态制剂是今后发展的方向，为此，笔者对宜春强微生物科技有限公司生产的乳酸粪肠球菌进行了对常见抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性，以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用研究，预期为微生态制剂在饲料中应用提供理论基础。
      本文为抗生素耐受性试验结果

1. 材料与方法
1.1、材料
1.1.1、药物及主要试剂：15%金霉素、15%杆菌肽锌、99%阿散酸、98%喹乙醇、10%硫酸粘杆菌素、50%吉他霉素、12%盐霉素，由江西省某饲料公司技术部惠赠。无菌生理盐水、1mol/L NaOH溶液由实验室自行配制；
1.1.2、培养基：
      LB培养基、HM（Mueller-Hinton）培养基，购自长城生物公司。
1.1.3、参照菌株：
      乳酸粪肠球菌标准菌株ATCC 29212；质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 25923，购自南昌市长城生物有限公司。受试菌株：大肠杆菌K88菌株、金黄色葡萄球菌购自南昌市长城生物公司；鸡白痢沙门氏菌，由江西农业大学预防兽医学教研组保存。
1.1.4、试验对象：
      强微乳酸粪肠球菌，由宜春强微生物科技有限公司提供。

1.2、方法：
1.2.1、乳酸粪肠球菌对抗生素的耐受性试验
      本试验严格根据美国临床试验室标准委员会(NCCLS)推荐的琼脂稀释法测定7种抗菌药对乳酸粪肠球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最高耐药浓度。
1.2.1.1、抗生素溶液的准备
      按《全国临床检验操作规程》将7种抗菌药物分别用相应试剂溶解后，用灭菌双蒸水稀释成5,120μg/mL的储存液，-80℃保存备用。试验时用灭菌双蒸水稀释至所需浓度。使用时再稀释成各种所需要的浓度。具体见表1。

表1：抗菌药物浓度稀释的配制方案 

1.2.1.2、菌液的准备与接种
      将送检乳酸粪肠球菌，接种于MH固体培养基，置37℃培养18-24小时，再分离纯化乳酸粪肠球菌为试验菌种。（编者注：由于本试验采用了将送检样品中的乳酸粪肠球菌分离纯化后，再进行耐抗生素试验，所以，还没有完全反映出强微乳酸粪肠球菌生产工艺中所采取的包埋保护后的耐受抗生素的效果）
      从平板上挑取单个菌落于LB液体培养基中，置37℃ 150rpm摇菌5h左右，并用LB液体培养基稀释至OD₆₃₀值为0.1(相当于细菌数1~2×10⁸ CFU/mL)备用。
      将抗菌药储存液倍比稀释成12个药物浓度（含原液13个浓度），将各浓度抗菌药各取2mL置无菌平皿，迅速加入18mL灭菌并冷却至约50℃的MH固体培养基混匀，倾注平板。使各平皿中药物最终浓度倍比稀释。庆大霉素仅制成浓度为500μg/mL的MH平板。
      再将菌液调整到浓度为l×10⁷ CFU/mL，分别取1μL菌液接种于加好药物的MH平板上，细菌最终接种量为1×10⁴ CFU/mL，置37℃恒温需氧环境培养18~24小时。观察细菌菌落生长情况。

1.2.1.3、药敏试验质量控制：
      每批实验以金黄色葡萄球菌ATCC 25923作常规药敏的质控菌株，以完全抑制菌落生长的最低药物浓度为MIC；以乳酸粪肠球菌标准株ATCC 29212作庆大霉素高水平耐药筛选质控菌株，在含500μg/mL庆大霉素的MH平板上不生长。实验重复两次，取两次结果平均数。质控结果均符合NCCLS2008年颁布的药物敏感试验解释标准。

1.2.2、乳酸粪肠球菌抑菌试验：采用牛津杯扩散法

1.2.2.1、将试验菌株大肠杆菌K88菌株、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌ATCC 25923复苏，分别接种营养琼脂培养基37℃培养18-24小时，从平板上挑取单个菌落于LB液体培养基中，置37℃ 150rpm摇菌5h左右，并用LB液体培养基稀释至OD₆₃₀值为0.1(相当于细菌数1~2×10⁸ CFU/mL)备用。

1.2.2.2、将乳酸粪肠球菌接种于MH固体培养基37℃培养18-24小时，钩菌于无菌蒸馏水，稀释到2×10⁹ CFU/mL为乳酸粪肠球菌实验用。

1.2.2.3、倾注营养琼脂培养基于平皿，每平皿药20mL培养基；冷却后置37℃恒温箱保温24h，以无任何微生物生长为合格培养基。将平皿正面朝上，置一水平桌面，迅速将灭菌牛津杯小心置于琼脂培养基，轻按，小心加入菌生素（2×10⁹ CFU/mL），每孔100μL，迅速加盖。

1.2.2.4、小心将加有牛津杯的平皿置37℃恒温箱培养24h，观察牛津杯周围的抑菌圈，并记录结果于下表。

2、结果
2.1、乳酸粪肠球菌对抗生素的耐受性试验结果
      对抗生素耐受性试验结果表明，该菌对七种抗生素有不同程度的耐受性，其对阿散酸耐受性最强，其次为杆菌肽锌，以下依次为喹乙醇、金霉素、硫酸粘杆菌素（抗敌素）、盐霉素，对吉它霉素耐受性最次，但仍然有较好的耐受性表现，具体见表2，图1~图7。

表2：乳酸粪肠球菌对七种抗生素的耐受性试验结果 

图1：耐金霉素试验结果

      图注：培养基中加有不同浓度的药物，加入相同数量的菌液于培养基表面，37℃恒温需氧环境培养18~24小时，如有菌落生长，即表示该菌能耐受该浓度的药物（下同），图1中第5块平皿开始有菌落出现，该平皿中金霉素为浓度160ppm，即该菌能耐受160ppm金霉素，而MIC即为320ppm。

图2：耐杆菌肽锌试验结果 

图3：耐阿散酸试验结果

图4：耐喹乙醇试验结果

图5：耐硫酸粘杆菌素试验结果

图6：耐吉他霉素试验结果

图7：耐盐霉素试验结果

2.2、乳酸粪肠球菌抑菌试验结果

     试验结果乳酸粪肠球菌对三种病原菌均有一定的抑菌能力，且对大肠杆菌有较强的抑制作用（笔者注：这一点在江西省农业科学院的养殖试验中也得到了体现，排泄的粪便中，添加乳酸粪肠球菌的试验组的粪便中的大肠杆菌数量比对照组要低85%之多），具体见表3图8。

表3：乳酸粪肠球菌抑菌试验结果 

图8：乳酸粪肠球菌抑菌试验结果图

3：小结与讨论

3.1、本次试验结果表明，强微乳酸粪肠球菌对7种药物有不同程度的耐药作用，其中对阿散酸效果最好，在最高浓度下均不能抑制乳酸粪肠球菌生长，其可以耐受2560ppm浓度的阿散酸浓度，超出国家规定添加量的200多倍；其次为杆菌肽锌，耐受浓度为1280ppm；其它如金霉素、喹乙醇、硫酸粘杆菌均在国家规定添加量以上。但对吉他霉素、盐霉素的耐性相对较差。

3.2、本次试验了对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和K88大肠杆菌的抑菌试验，试验结果乳酸粪肠球菌对三种病原菌均有一定的抑菌能力，且对大肠杆菌有较强的抑制作用