光合细菌对植物抗病毒活性物质诱导作用的研究

• 前言

这里主要研究光合细菌（Phototrophic Bacteria中的Rhodopseudomonas Sphaeroides P4株菌）在植物抗病毒方面的研究。

光合细菌（Phototrophic Bacteria）是一类含细胞叶绿素和多种类胡萝卜素等光合色素，能进行光合作用的原始的细菌，它们广泛分布于土壤及各种水域环境中，分类上属于真菌纲，红螺细菌目。光合细菌有多种代谢方式，除了利用光能之外，有许多菌侏还能在黑暗环境中通过发酵或在好氧条件下通过氧化磷酸化获取能量。它们还具有利用多种有机物的能力，在自然界的碳，氮，硫等元素的物质循环中起着重要的作用。

光合细菌菌体含蛋白质60%以上，其质量相当于酵母蛋白质，并富含有多种维生素，特别是动物幼体生长发育所需要的VB12，叶酸，生物素等，光合细菌中的某些菌株，还含有刺激动物免疫系统，增强机体抗病能力的活性物质和促生长因子，因此作为饲料添加剂在畜禽水产养殖业上已得到了广泛的应用。

由于光合细菌所具有的某些特殊的生理功能，它们在农业上也有着广泛的应用，如现代农业中大量使用化肥和农药的结果导致土壤中残留毒物如硫化氢和硝酸盐等浓度很高，影响农作物的根系发育，光合细菌的使用，能有效地分解这些物质，具有改良土壤的作用，另一方面，光合细菌与土壤中的有益微生物如放线菌具有共生的关系，放线菌的增殖对土壤中的有害菌，特别是丝状菌，具有杀灭和抑制作用，此外，光合细菌的水解液中富有脯氨酸，和尿嘧啶，这些物质用于作物的生殖生长期，能促进花芽形成，提高结实率和提高果实的品质等作用。

近期的研究报导了光合细菌中的核苷酸提取物和某些未知的复合因子对某些噬菌体（如PHAGE  ADENOVIRS等）具有抑制其在寄生细胞中增殖的活性，在动物试验中我们发现它具有增强肉鸡传染性支气管炎病毒的抵抗力的功能。因此这启发了我们在农业上进行光合细菌抗病毒活性的应用研究。本文探讨了光合细菌抗病毒性并确定了这种活性是通过增强植物本身具有免疫机制而实现的，并非具有直接的杀伤病毒的作用，同时也初步分析了菌体培养液中哪些是抗病毒的有效成份，由于农业上病毒传染性强，传播范围广，常常造成作物大批损伤和死亡，目前还缺少确切有效的防治药物，因此，开展这方面的研究是十分具有意义的。

• 材料与方法

   ㈠ 试验样品
   1、光合细菌Rhodopseudomonas Sphaeroides P4株菌的分离，鉴定及培养。
    从自然界取富营养化污水，经液体光照厌氧培养富集，分离得到纯菌体，该菌在电子显微镜下呈椭圆形，单根极生鞭毛，以二分法增殖，能在好氧条件下生长。平皿上的菌落呈园形，红色，根据其碳源利用性和生理，形态特征可初步确定该菌为红假单胞菌属的球形经假单胞菌Rhodopseudomonas Sphaeroides
    菌体培养液，样品A：把分离得到的菌体接种于经消毒后的培养液中，在厌氧光照（2000LX 以上）28℃下培养3天，得到了20亿/克浓度的样品A。
    2、菌体破碎液（样品B）
    P4株培养液经4000rmp离心分离20分钟，所得的菌体用磷酸缓冲液（0.05M，PH7）洗涤二次，再悬浮于缓冲液中，用250W的超声波处理10分钟（在盐冰浴中处理20秒钟，停顿10秒的程度处理进行）
    3、滤液（样品C）
    细菌培养液经细菌过滤器除去菌体，所得的滤液为样品C
    4、菌体细胞壁组份（样品D）
    菌体经超声波破碎后，以20000rmp离心20分，所得组份主要为细胞壁，分离得到组份，用磷酸缓冲液稀释到原培养液浓度，作为样品D。
    5、经离心得到的上清液，主要是细胞壁及可溶性的细胞质成分。为样品E。

㈡ 病毒与指示植株。
    1、攻击病毒为香石竹斑驳病毒（Carnation Mottle virus-camv），批示植物为苋色藜。
    2、攻击病毒为黄瓜花叶病毒（Cueumber mosaio-virus-cmv），指示植物为蚕豆。
    3、攻击病毒为烟草花叶病毒(Tobaoo mosaic virus-tmv)，指示植物为心叶烟草。
    本试验接种源都是以发病叶片粗提取汁液，稀释10倍，分别用毛笔涂抹或金钢砂磨擦方式接种。

• 试验结果

1、攻击病毒以磨擦方式接种于植物叶片后，即刻用A，B，C，D，E样品（都稀释100倍）喷洒于叶片，以后每隔2天喷洒一次，对照样品用磷酸缓冲液喷洒，以植株叶面出现病斑为发病依据，试验表明，攻击病毒磨擦接种于植株后，即刻喷洒各种试验样品，各组植株相继发生病症，因为试验在夏天进行，TMV感染力极强，所以TMV心叶烟草组发病最快，其他两组CaMV感染苋色藜和CMV感染蚕豆的情况中除C样品（滤液）与对照样品喷洒的植株发病时间基本相同外，A，B，D，E各样品喷洒的植株均能体现一定的延缓发病的趋势，并以A，B的作用稍为明显。见图一。
 
    2、攻击病毒接种前一周，用A，B，C，D，E及对照样品（均稀释100倍），每天喷洒一次。经七天后再磨擦接种病毒于指示植株，以后每隔二天喷洒种种样品一次，结果如下：
   ① CAMV苋色藜组，接种病毒七天后，在对照和C试验样品喷洒的植株上均出现退绿斑，二周后，叶片坏死掉落，植株逐渐枯死，其它A，B，D，E试验样品喷洒后，在接种病毒后10天时，试验植株才可看到退绿斑，而且数量也很少，症状轻，以后又逐渐消失，二周后试验植株均与正常植株无异常。
   ②CMV蚕豆组，在接种病毒四天后，在对照组和C组上出现枯斑，一周后叶片开始掉落，在A，B，D，E喷洒的植株上均无发病症状，试验植株与正常植株无异。
   ③TMV心叶烟草组：接种病毒二天后，对照和喷洒C样品的植株首先产生病症，A，B，D，E各样品喷洒的植株相继在4—6天后出现病症。
  3、用A，B，C，D，E及对照样品稀释不同浓度后，每天喷洒植株一次，一周后，再用TMV涂抹接种心叶烟草病毒草，得到表一所列的结果。
  表一：不同稀释度的各种样品诱导试验植株后，心叶烟草抗TMV病毒的情况比较。

• 结果与讨论

  1、各试验植株在接种病毒后，即喷洒各试验样品，各试验植株相继都发病，说明各样品都无直接杀伤病毒的作用，但A，B，D，E等样品对CMV，CAMV感染的植株有延缓发病的趋势，为此表明了这几种样品有一定的抑制病毒在寄主细胞中增殖的活性，其中以A，B样品较为明显。
  2、先用各样品喷洒一周后，再用病毒感染植株试验，A，B，D，E各样品均有诱导植株增强其抗病毒能力的活性，其中CMV和CAMV感染的植株表现为病症减轻或不发病，而TMV感染的植株因采用的磨擦接种而发病来势很猛，各样品均不能体现抗TMV病毒的活性。
  3、如果各样品先每天喷洒一次，经一周的诱导后，再用TMV涂抹接种于心叶烟草上，则在A，B样品稀释度小于100倍，D样品不稀释的情况下，均能起到明显增强试验植株抗TMV的能力，试验植株不发生病症。
    上述两点说明P4菌光合细菌能够诱导植株增强其抗病毒能力的活性，而且这种作用是非特异的，从已试验的情况来看，可能对很多植株病毒都有这种活性。
  4、菌体培养液样品A，菌体破碎液中均有较好的诱导效应，另外，主要是细胞壁组份的样品D和细胞内含物样品E也有一定效果，但效果较差而已，因此可以认为，这种抗病毒作用的活性是通过菌体中各组份综合作用的结果，但滤液样品C几乎没有这种活性，这进一步说明了P4光合细菌的代谢产物没有这种活性，活性是由菌体本身作用而产生的。
   上面的试验证实了光合细菌P4菌株能诱导植株增强其抗病毒能力的活性。至于经诱导植株生理上发生了哪些变化，如P4菌株是诱导植株产生某些抗病毒物质还是造成不利于病毒增殖的客观环境条件而实现抗病毒作用的机理，有待进一步深入研究。