不同复合益生菌对锦江黄牛瘤胃体外发酵的影响试验报告
（江西农业大学江西省高校动物营养重点实验室 瞿明仁 南昌 330045）
（宜春强微生物科技有限公司 宜春 336000）
笔者注：本试验是为强微公司将来的新产品：“强微肠精益”，所进行了前期探索性试验，是强微公司与江西农大协同创新产学研合作项目之一。
摘要：为探讨四种不同组成的复合益生菌制剂对锦江黄牛瘤胃体外发酵的影响，采用体外培养方法进行研究, 设5个组，即不添复合益生菌的基础日粮为对照组，4个试验组分别添加I、II、III和IV号复合益生菌，添加量均为在基础日粮中添加200mg/kg。进行体外培养24小时，测定培养液各项指标。结果表明：（1）I、II、III、IV复合益生菌和对照组的培养液pH值均在正常范围内。（2）I、II、III复合益生菌的24小时总产气量与对照组有显著的提高( P <0. 05)，以II号复合益生菌的产气量最高为170.50 ml；（3） I、II号复合益生菌微生物蛋白含量极显著高于其他组( P <0. 01)，其中II号复合益生菌的微生物蛋白含量最高达270.43 mg/100ml；（4）I、II、III复合益生菌氨态氮浓度极显著低于对照组和第IV号复合益生菌( P <0. 01)；（5）II、III号复合益生菌干物质降解率极显著高于对照组( P <0. 01)；（6）I、II、III号复合益生菌丙酸和总VFA浓度极显著高于对照组( P <0. 01)，II号丙酸浓度、总挥发性脂肪酸最高，乙酸/丙酸值极显著低于对照组 ( P <0. 01)。
结果提示:添加复合益生菌能够稳定瘤胃内环境，促进瘤胃发酵功能改善;以II号复合益生菌效果最佳，但最佳添加量和体内效果有待进一步研究。
关键词：复合益生菌；锦江黄牛；瘤胃；体外发酵
微生态制剂以其天然、无毒、无副作用、无残留、安全可靠、不污染环境的优越性成为发展绿色畜禽产品和替代抗生素首推的饲料添加剂之一。我国农业部规定可用于生产微生态制剂的微生物有16 种, 主要为乳酸菌类，酵母菌类和芽孢杆菌类三大类[ 1] 。本课题组研究发现乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液耐受性比较强，处理3小时，存活仍有95%以上（瞿明仁等，2012）[ 2]。大量研究证明, 科学的复合制剂对动物有协同和互补作用。因此，本课题组在前期研究的基础上，以产乳酸粪肠球菌、酵母菌和芽孢杆菌（地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌）为主，配制了四种复合益生菌。本研究利用体外培养的方法，评定四种复合益生菌制剂对江西锦江黄牛瘤胃体外发酵培养的影响，以期筛选出最佳的复合益生菌组合，为在肉牛中的生产应用提供技术支持。
１ 材料与方法
1.1复合益生菌：
由江西农业大学动物营养与饲料科学重点实验室与宜春强微生物科技有限公司联合研制和生产，代号分别为I、II、III、IV，共四种。复合益生菌由产乳酸粪肠球菌、酵母菌和芽孢杆菌（地衣芽孢杆菌和枯草芽孢）按一定比例和工艺制备而成，见表1。
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表1 复合益生菌组成
Table 1 The composition of complex-probiotic-preparations
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复合益生菌complex
-probiotic-preparations
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组 成composition
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I
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乳酸粪肠球菌、酵母菌为主，加适量芽孢杆菌
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II
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以酵母菌为主，加适量的乳酸粪肠球菌、芽孢杆菌
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III
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以酵母菌、芽孢杆菌次为主，加适量乳酸粪肠球菌
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IV
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主要以酵母菌及其代谢产物为主
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1.2 试验动物与基础日粮
选用2 头体重为( 275±15) kg 安装有永久性瘤胃瘘管的健康锦江黄牛，以供瘤胃液的采集。试验动物每天饲喂2 次( 08: 00 和18: 00) ，自由饮水。基础日粮为玉米-豆粕-稻草型日粮，按肉牛1.3倍维持需要配制，精粗比为60∶40，基础日粮组成和营养水平见表1。
体外培养试验设5个组，即不添复合益生菌的基础日粮为对照组，4个试验组分别添加I、II、III和IV号复合益生菌，添加量均为在基础日粮中添加200mg/kg。
表2 基础日粮组成及营养水平
Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet
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日粮组成
Ingredient
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比例（%）
Percentage
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营养水平
Nutrient levels
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含量
Content
|
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稻草 Straw
玉米Corn
豆粕Soybean
石粉 Limestone
预混料 Premix
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40.0
52.8
5.4
0.3
1.5
|
干物质 DM（%）
综合净能 NE（MJ/kg，DM）
粗蛋白 CP（%，DM）
P (%,DM)
Ca（%，DM）
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88.97
6.10
8.82
0.31
0.47
|
注：每kg预混料含：维生素A 200 000IU；维生素D3 30000IU；维生素E 600 IU；铜 300mg；铁 2000mg；锰 1200mg；锌 1500mg；硒 20mg；碘 30mg；钴 10mg;钙 100-200g；磷 50-100g；食盐 14.00-20.00%
1.3体外培养试验
1.3.1体外培养装置
体外批次培养装置参照卢德勋等[3]和程茂基[4]的方法进行。该装置主体为恒温水浴摇床，其水浴温度和震荡速率可调。培养瓶为瓶口安装有橡皮塞的150 mL奶瓶，橡皮塞上接有带三通阀的橡胶管，三通阀可打开和关闭，三通阀一端与25mL 医用玻璃注射器相连，注射器用于测定体外培养过程中的产气量。
1.3.2瘤胃液采集
于晨饲前由2头锦江黄牛瘤胃内上下左右( 背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊) 不同位点采集足量瘤胃液，灌入经预热达39 ℃并通有CO2的灭菌清洁烧杯中，烧杯置于装有39 ℃ 蒸馏水的保温瓶中，灌满后立即盖好保温瓶盖子，迅速返回实验，经4层纱布过滤后持续通入CO2气体5min，然后迅速分装至已预热好并装有培养底物和人工唾液的培养瓶内(每个培养瓶加20mL瘤胃液)。接通培养瓶和注射器，打开振荡开关，开始培养。
1.4 样品的预处理
培养24h后，将培养瓶取出，立即测定其pH值，然后将培养物用纱布过滤，滤渣无损失地转移入100ml大坩埚中，置于65℃烘箱中烘干，以测定干物质降解率。滤液转移至
100ml大离心管中，以1500r/min离心15min，去除原虫和饲料大颗粒。取上清液保存，以备分析BCP浓度、NH3-N浓度和VFA浓度。
1. 5 指标的测定
1.5.1 产气量：每隔半小时记录注射器的气体量，记录完后排气，累计培养24小时的总产气量。
1.5.2 瘤胃液pH 值：培养24小时后立即用PHS-320酸度计（上海密通机电科技有限公司）直接测定。
1.5.3 瘤胃液NH3-N浓度：参照冯宗慈等的比色法进行测定[5] 。
1.5.4 瘤胃液菌体蛋白（MCP）的测定：
取经预处理去除原虫和饲料大颗粒的上清液10ml，以16000×g离心20min，弃去上清液，沉淀的细菌部分加入9ml 10%三氯乙酸溶液，混匀，再以4000r/min离心10min，取沉淀物加入5%氢氧化钠溶解，然后稀释至25ml。此稀释液又经4000r/min离心10min，取上清液在紫外分光光度计上用280nm和260nm波长进行比色。应用下面公式求得细菌蛋白质含量：
细菌蛋白质含量（mg/ml）=(1.45×D280-0.74×D260) ×稀释倍数
1.5.5 瘤胃液VFA 浓度。按照戈婷婷等的气相色谱法进行测定[6]。
1.6 数据处理
采用Excel 2003和Spss16. 0软件对试验数据进行方差分析和显著性检验。
2 结果与分析
2.1不同复合益生菌体外培养产气量、pH值、MCP含量、NH3-N浓度和干物质降解率
表3 不同复合益生菌制剂对培养液产气量、pH值、MCP含量、NH3-N浓度和干物质降解率影响
Table 3 Effects of different kind of complex-probiotic-preparations on gas volume, pH, MCP, NH3-N and DM
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组别
Groups
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pH值
pH value
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产气量
gas volume ml
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氨态氮NH3-N
mg/100ml
|
微生物蛋白MCP
mg/100ml
|
干物质降解率DM,%
|
|
对照组control
|
5.18±0.01
|
157.00±3.0a
|
22.47±0.09cB
|
220.67±3.84aA
|
31.16±0.05aA
|
|
I
|
5.17±0.01
|
168.00±1.5b
|
20.96±0.02aA
|
250.24±1.46cB
|
32.34±0.39bcAB
|
|
II
|
5.17±0.01
|
170.50±1.5b
|
20.74±0.16aA
|
270.43±1.69dC
|
33.08±0.20cC
|
|
III
|
5.18±0.01
|
169.00±2.5b
|
21.08±0.08aA
|
230.62±1.62bA
|
32.64±0.14cBC
|
|
IV
|
5.17±0.01
|
163.50±1.5ab
|
21.99±0.03bB
|
223.72±3.57abA
|
31.70±0.06abAB
|
注: 同列肩标相同字母表示差异不显著(P >0. 05 )，不同小写字母表示差异显著(P < 0. 05 ), 不同大写字母表示差异极显著(P < 0. 01)。下表同。
Note: Same small letters in the column stand for not significant differences (P >0. 05), different small letters stand for significant differences (P< 0. 05), different capital letters stand for extremely significant differences (P< 0. 01), the same as follows.
由表3可见，添加I、II、III、IV复合益生菌和对照组的培养液pH值均在正常范围内。添加I、II、III复合益生菌的24小时总产气量与对照组有显著的提高( P <0. 05)，各处理组间差异不显著( P >0. 05)但以II号复合益生菌的产气量最高为170.50 ml； I、II号复合益生菌微生物蛋白含量极显著高于其他组( P <0. 01)，其中II号复合益生菌的微生物蛋白含量最高达270.43 mg/100ml，而且显著高于I、III号( P <0. 05)；I、II、III复合益生菌氨态氮浓度极显著低于对照组和第IV号复合益生菌( P <0. 01)，IV号复合益生菌显著低于对照组( P <0. 05)；II、III号复合益生菌干物质降解率极显著高于对照组( P <0. 01).
2.2不同复合益生菌制剂瘤胃液挥发性脂肪酸浓度
表4 添加不同复合益生菌对瘤胃液挥发性脂肪酸浓度的影响
Table 4 Effects of different kind of complex-probiotic-preparations on VFA
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组别Groups
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乙酸mmol /L
Acetic acid
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丙酸mmol /L
Propionic acid
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丁酸mmol /L
Butyric acid
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总VFAmmol /L
Total fatty acids
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乙酸/丙酸
Acetic acid / propionic acid
|
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对照组control
|
81.07±0.21a
|
48.25±0.55aA
|
10.37±0.28a
|
139.69±0.17aA
|
1.68±0.01cB
|
|
I
|
81.87±0.16bc
|
50.80±0.23bB
|
11.84±0.41b
|
144.51±0.99bB
|
1.61±0.01bA
|
|
II
|
82.10±0.26c
|
52.08±0.19cB
|
11.77±0.13b
|
145.96±0.63bB
|
1.58±0.01aA
|
|
III
|
82.17±0.08c
|
51.86±0.07bcB
|
11.86±0.05b
|
145.89±0.10bB
|
1.58±0.01aA
|
|
IV
|
81.18±0.26ab
|
48.69±0.09aA
|
10.80±0.20a
|
140.67±0.12aA
|
1.67±0.01cB
|
由表4可见，与对照组相比，I、II、III号复合益生菌的乙酸和丁酸浓度显著高于对照组和IV号复合益生菌( P <0. 05)，丙酸和总VFA浓度极显著高于对照组( P <0. 01)，乙酸/丙酸值极显著低于对照组和IV复合益生菌( P <0. 01)，而IV号复合益生菌挥发酸浓度虽比对照组高一些但差异不显著( P >0. 05)。各处理组之间比较，II号丙酸浓度为52.08mmol /L显著高于I 号( P <0. 05)，I号和III号差异不显著( P >0. 05)；II号总挥发性脂肪酸浓度最高，但是处理组间差异不显著( P >0. 05)，II、III号的乙酸/丙酸值显著低于I 号( P <0. 05)。
3 讨 论
3.1复合益生菌对瘤胃内环境稳定性的影响
瘤胃pH 是评价瘤胃内环境是否稳定的基本指标, 它主要受唾液、饲粮及瘤胃微生物区系的影响。本试验体外培养24小时后各组瘤胃液pH都较低，这可能是由于本试验的精粗比为6：4比较高，体外培养试验不能像体内试验那样，将微生物代谢产生的有机酸吸收、排出或中和，再加上，使得产生的酸一直在培养瓶中蓄积，导致pH值较低。但各组pH值与对照组无显著差异，说明添加四种符合益生菌没有破坏瘤胃内环境的稳定性。姜艳美[7]等研究发现添加酿酒酵母菌对人工瘤胃酸碱内环境没有造成不良影响，瘤胃pH差异不显著,刘彩娟等[8]通过饲养试验表明添加复合益生菌对奶牛瘤胃pH影响不显著( P <0. 05) 这些研究结果与本研究一致，说明使用复合益生菌不影响瘤胃pH, 而且可能对瘤胃内环境具有稳定作用，促进瘤胃微生物在良好的瘤胃环境下生长繁殖。
3.2复合益生菌对瘤胃发酵功能的影响
本试验发现，添加复合益生菌24小时总产气量与对照组有显著的提高( P <0. 05)，说明添加复合益生菌后，瘤胃微生物生长繁殖旺盛。而且I、II号复合益生菌微生物蛋白含量极显著高于对照组( P <0. 01)，其中II号复合益生菌的微生物蛋白含量最高达270.43 mg/100ml；I、II、III复合益生菌氨态氮浓度极显著低于对照组 ( P <0. 01)， II、III号复合益生菌干物质降解率极显著高于对照组( P <0. 01). I、II、III号复合益生菌的丙酸和总VFA浓度极显著高于对照组( P <0. 01)，乙酸/丙酸值极显著低于对照组 ( P <0. 01)，Beauchemin 等[9] 报道,给育肥牛饲喂屎肠球菌能够提高瘤胃丙酸的浓度。Miller-Webster[ 10] 认为, 高浓度的VFA, 尤其是高浓度的丙酸可保证牛奶中乳糖含量。Harrison报道, 酵母培养基添加于荷斯坦乳牛的日粮中, 使瘤胃内乙酸、乙酸与丙酸比例降低。杨朋飞（2009）[11]研究表明：奶牛每天饲喂5g BLCS微生态制剂可改善奶牛瘤胃发酵功能,显著降低瘤胃内NH3-N浓度,提高菌体蛋白(BCP)、乙酸、丙酸与总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度,这与本研究结果一致，说明瘤胃发酵功能得到了改善。
3.3复合益生菌组成对瘤胃发酵功能影响及适宜组成
易维学(2010) [12]研究表明粪肠球菌和枯草芽孢杆菌均可较好的抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长；粪肠球菌对嗜酸乳酸杆菌可以起到较好的促生长作用。范利霞（2010）[13]研究表明,乳酸菌、芽孢杆菌产生的有机酸及其代谢产物对一些病原菌有抑制作用,并能激活免疫活性细胞,增强机体免疫力;酵母培养物营养丰富,可促进有益菌的生长、抑制病原菌的繁殖,提高机体免疫能力,并对防治畜禽消化道系统疾病起到有益作用。本课题组研制的I、II、III号复合益生菌是以酵母菌、乳酸粪肠球菌、芽孢杆菌复配而成的。本课题组研制的四种复合益生菌对瘤胃内环境具有稳定作用，同时改善了瘤胃发酵功能是与酵母菌、乳酸粪肠球菌、芽孢杆菌等3种微生物特性和功能相符合的。从研究结果来看，以II号复合益生菌效果最佳，但最佳添加量有待进一步研究。
4 结 论
1、添加复合益生菌能够稳定瘤胃内环境，促进瘤胃发酵功能改善
2、在以II号复合益生菌效果最佳，但最佳添加量和体内效果有待进一步研究。
参考文献：
[1] 那日苏, 桂荣. 牛用益生素的研究与应用[J ]. 饲料研究, 2002(12):10- 13.
[2] 包淋斌，邬向东，瞿明仁等. 乳酸粪肠球菌对pH、胃液、肠液、胆盐耐受性研究.2012年待发表
[3] 卢德勋，谢崇文.现代反色动物营养研究方法和技术[M].北京:农业出版社，1991
[4] 程茂基.绵羊瘤胃内寡肤的产生、降解、吸收、流通与微生物摄取规律的研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学，2000
[5] 冯宗慈, 高民. 通过比色法测定瘤胃液氨氮含量方法的改进[ J]. 内蒙古畜牧科学, 1993( 4): 40- 41
[6] 戈婷婷,瞿明仁. 功能性寡糖对锦江黄牛瘤胃发酵及微生物生长效率的影响[ J].动物营养学报,2012， 24( 3) : 557-562
[7] 姜艳美.酵母菌培养物对瘤胃发酵的影响[ J].动物营养学报,2008.
[8] 刘彩娟. 饲粮中添加复合益生菌对奶牛瘤胃发酵及纤维素酶活的影响
[9] Beauchemin K A ,Yang W Z ,Morgavi D P ,et al . Effect s of bacterial direct fed microbials and yeast on site and extent of digestion , blood chemistry , and subclinical ruminal acidosis in feedlot cattle [J ] . J Anim Sci ,2003 ,81 :162821640.
[10] Miller-Webster T, Hoover W H , Holt M , Nocek J E. Influence of y east culture on ruminal microbial metabolism in continuous culture. Journal of Dairy Science, 2002, 85( 8) : 2009- 2014.
[11]杨朋飞. 微生态制剂-BLCS对奶牛瘤胃发酵特性、产奶性能及营养物质消化率的影响[D]. 内蒙古农业大学硕士学位论文，2009.
[12]易维学. 饲用粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的体外评价研究[D]. 华中农业大学硕士学位论文，2010.
[13] 范利霞. 复合微生态制剂的研制及其对反刍动物免疫机能的影响[D]. 内蒙古农业大学硕士学位论文，2010.
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