程鹏辉，廖新俤*，吴银宝

(华南农业大学动物科学学院，广东广州510642)

    摘要:研究添加杂交狼尾草对肥育猪生产性能和大肠微生物区系的影响。选取体重60 kg的杜长大三元杂交猪72头，分为4组，每组3个重复，在饲粮中添加不同比例的杂交狼尾草；采用PCR-DGGE测定猪粪便微生物菌群的多样性。结果表明：全价料与杂交狼尾草的添加比例为1∶0.8、1∶1、1∶1.2时，组间肥育猪日增重没有显著差异；当比例为1︰1时，饲料转化率为3.06。研究还表明，日粮中添加杂交狼尾草增加大肠中的细菌种类和细菌总数，随着杂交狼尾草添加量和持续时间的不同，粪便细菌的种类和数量增加的幅度不同；在第14天后肥育猪粪便菌群的多样性参数保持稳定；全价料与杂交狼尾草的比例为1∶1时，第28天菌群的多样性参数最高，说明此替代比例比较合适。以上结果说明适量投喂杂交狼尾草对肥育猪是可行的。

 

    我国人畜争粮的矛盾日益加剧。大量试验证实，牧草可以在现代养猪业中作为能量和蛋白饲料资源利用，适宜的替代量能促进猪生产性能的提高，降低成本[1，2]。

    杂交狼尾草(crossbred pennisetum)是一种适宜长江流域及以南地区种植的高产优质牧草，在生长或肥育猪饲料中具有广阔的发展前景。但是替代的比例问题一直受人们关心，目前衡量适当的比例主要从营养物质的吸收与代谢、肉质、肠道生长发育等方面来考虑。

    但是大肠微生物是猪消化系统的一个组成部分，对营养物质消化和吸收起着重要的作用。牧草用于猪饲料中，其中的纤维物质主要在大肠被微生物发酵利用，因此大肠微生态的变化可以反映牧草的替代比例是否合适，但是目前鲜见相关的报道。本试验旨在研究肥育猪饲粮中添加不同比例的杂交狼尾草对肥育猪生产性能和大肠微生物区系的影响，为其在生产中的实际运用提供依据。

 

    试验选择杜洛克×(大白×长白)三元杂交猪72头，按照“胎次一致、品种相同、体重相近、公母各半”的原则，随机分为4个处理，每个处理组3个重复，每个重复6头猪。

 

    根据日粮中添加新鲜杂交狼尾草的比例，试验设4个处理，Ⅰ组为对照组(不添加狼尾草)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为试验组，各组基础日粮与新鲜杂交狼尾草的比例依次为1∶0.8、1∶1.0和1∶1.2。

    试验采用杂交狼尾草的营养水平(占干物质的比例)：蛋白质23.69%、粗纤维25.23%、粗脂肪2.27%、粗灰分11.27%。

    试验基础日粮组成：玉米64%、豆粕24%、麸皮8%，预混料4%。基础日粮营养水平为消化能13.26MJ/kg、粗蛋白16.77%、粗纤维3.06%、赖氨酸1.14%、钙0.69%、磷0.56%。

 

    开放式猪舍，水泥地板，鸭嘴式饮水器，每天07:00和15:00进行水冲清粪。每栏饲养6头猪。新鲜的杂交狼尾草采用打浆后与全价料混匀投喂，饲喂方法采用群饲，每日喂料2次，投料时间分别为08:00和16:00，自由饮水和采食。试验猪在同一栋猪舍的不同圈舍内饲养，各处理组的饲养管理与环境条件均一致。每天06:30和14:30记录各栏的剩料量。

 

    正式饲养试验开始时称重;饲养试验结束，空腹称重，依此计算出总增重(TG)、平均日增重(ADG)。

    采食量(FI)：每天记录投料量与剩料量，投料量减去剩料量即得采食量，最终计算出各试验组猪的平均日采食量，其中剩料量中全价料与草料的比例按照投料中全价料与草料的比例估算。

 

    参照Simpson等[3]收集粪便的方法，在猪饲养试验期间，从每个处理间选择体重接近，正常采食的肥育猪3头(即每个栏选1头，编号)，收集粪便的时间为第14天和第28天。每天上午冲栏和喂料后，进行粪便采集，每份约50 g，将粪样混合均匀后装入预冷的密封采样袋中。样品立刻置入-20℃下冻存备用。

 

    P3-GC-f:5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′

    P2-r:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′

    扩增条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，33个循环，最后72℃再延伸10 min。

1.6.3 DGGE分析PCR产物用Bio-Rad Dcode sys- tem(hercules，CA)进行DGGE电泳。变性梯度凝胶的浓度为42%~60%;点样PCR的扩增产物和标准菌株(Mark)后，先用200 V电压约10 min，待样品进入胶后50 V，温度稳定为60℃，电泳21 h后银染，利用UVI凝胶成像系统对染色后的凝胶进行成像，用Labwork4.0图象分析软件(Gene Company Limited，基因公司)对图象进行分析。

    首先计算各泳道的条带数，同时对泳道中每个条带的强度进行分析并进行量化，计算不同泳道Shan-non′s多样性参数。Shannon′s多样性参数的公式为:

    式中，S为每个泳道的条带数，pi为每个条带数占总条带数强度的比例，H′值越大说明样品的多样性程度越高。

 

1.7统计方法采用SAS8.1版软件对数据进行统计与分析，用ANOVA程序进行单因素方差分析，同时进行Duncan氏多重比较，显著水平P<0.05。数据统计结果用平均值±标准误表示。

 

2.1杂交狼尾草对肥育猪生产性能和平均采食量的影响猪生产性能测定结果见表1。

    表中可见，试验猪初始体重平均为60.14 kg，各试验组间差异不显著(P>0.05)。28 d试验结束后，所有试验猪的平均增重为17.88 kg，经检验各组间差异不显著(P>0.05)，各组间日增重差异也不显著(P>0.05)。

    试验猪平均日采食由全价料和杂交狼尾草2部分构成。由表2可见，随着杂交狼尾草添加量的增加，试验猪采食全价料的量减少，采食杂交狼尾草的量增加。

    Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组与对照组(Ⅰ组)比较，日采食量中全价料量分别减少了0.2、0.39和0.44 kg，但是杂交狼尾草的量分别增加了1.79、2.05和2.40 kg。杂交狼尾草替代部分全价料，饲料转化率提高，其中Ⅲ组最低，与对照组(3.73)相比，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组分别降低了0.23、0.67和0.35，因此处理组的饲料报酬提高。

表1杂交狼尾草替代部分全价料对肥育猪生产性能的影响

组别	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ
平均始重/kg	59.50±6.55	60.58±4.32	59.53±3.18	60.94±4.91
平均增重/kg	18.28±0.89	17.89±0.48	18.77±1.27	16.59±0.93
平均日增重/(g·d-1)	652.78±31.28	638.89±17.13	670.14±45.14	592.02±57.30

 

表2杂交狼尾草替代部分全价料对肥育猪平均采食量和饲料转化率影响

组别	Ⅰ		Ⅱ		Ⅲ		Ⅳ
	全价料	狼尾草	全价料	狼尾草	全价料	狼尾草	全价料	狼尾草
平均日采食量/kg	2.44	0	2.24	1.79	2.05	2.05	2.00	2.40
饲料转化率	3.73		3.50		3.06		3.38

 

    谱从图1可以看出，1~8每种粪便微生物DNA的扩增产物，经过变性梯度凝胶电泳都可以分离数目不等的电泳条带，且各条带的强度和迁移率各不相同。同时，各泳道之间又具有许多共同的电泳条带，除Mark泳道外，其余8个泳道中均有乳酸杆菌(L.acidophilus)、埃希氏大肠杆菌(E.coli)和j、k、l的条带，这说明大肠中可能存在这几种条带所代表的基本微生物菌群。相同采样时间，不同处理组猪的PCR-DGGE图谱中既有相同条带，也有不同的条带，有的条带在相同位置明暗程度也明显不相同;不同取样时间猪的PCR-DGGE图中的优势条带发生明显的变化。如Ⅰ组第14、28天粪肠球菌(E.faecalis)的条带较暗或没有，但是Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组第14、28天粪肠球菌(E.faecalis)的条带较亮，这说明粪肠球菌(E.faecalis)为处理组中的优势菌群。

 

2.3不同处理对肥育猪菌群PCR-DGGE图谱多态性的影响从表3中可以看出，第14天不同处理组的电泳条带数有差异。其中，Ⅱ组最高，Ⅰ组最低;Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组之间差异不显著(P>0.05)，但是Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组之间差异显著(P<0.05);第28天时不同处理组的电泳条带数也有差异。其中，Ⅱ组最高，Ⅰ组最低，两者之间差异显著(P<0.05)，Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05);Ⅱ、Ⅲ组均与Ⅳ组之间差异显著(P<0.05)，Ⅳ组与Ⅰ组之间差异也显著(P<0.05)。这说明粪便微生物种类的多少随着纤维性饲粮添加量的增加而增加，并且在不同时期处理之间变化的趋势不一样。

表3各处理组肥育猪粪便PCR-DGGE电泳条带数的变化

时间/d	组别
	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ
14	17.35±1.20b	27.67±0.67Ba	25.33±0.67Ba	27.33±0.88a
28	20.00±1.00c	36.33±0.88Aa	34.00±2.00Aa	30.67±0.88b

注:同行数据肩标不同小写字母差异显著(P<0.05)，同列数据肩标不同大写字母差异显著(P<0.05)。下表同

    从表3中也可以看出，电泳条带数量在第14和28天时，Ⅰ组差异不显著(P>0.05)，但是Ⅱ组和Ⅲ组在第28天时的条带数高于第14天的条带数，并且差异显著(P<0.05)，Ⅳ组在第28天时的条带数高于第14天的条带数，但是差异不显著(P>0.05)。这说明日粮中一定量的纤维性物质会随着时间的变化而改变粪便中微生物种类。

    根据公式可以计算出Shannon′s多样性参数，由于同时考虑了条带数量与各条带数强度的比例，所以Shannon′s多样性参数能更准确地反映各处理组肥育猪粪便菌群的变化情况。从表4可以看出，在第14和28天，处理组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)之间差异不显著(P>0.05)，但处理组均高于对照组(Ⅰ组)，并且它们之间差异显著(P<0.05)。这表明肥育猪粪便菌群的多样性参数随着纤维性饲粮的增加而增加。

表4各处理组肥育猪菌群PCR-DGGE电泳多样性参数的变化

时间/d	组别
	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ
14	2.48±0.26Ab	2.93±0.09Aa	2.99±0.03Aa	3.07±0.02Aa
28	2.75±0.11Ab	3.15±0.11Aa	3.20±0.08Aa	3.03±0.09Aa

    从表4中也可以看出，每个组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)分别在第14天的菌群多样性参数与第28天的多样性参数差异均不显著(P>0.05)。这说明在第14天后肥育猪粪便菌群的多样性参数不会随时间的变化而变化，基本上保持稳定。

 

    单胃动物，但猪的大肠发达，具有大量高活性的反刍纤维分解菌和半纤维分解菌。猪大肠内微生物发酵产生的最终产物是挥发性脂肪酸和甲烷，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。挥发性脂肪酸由后肠迅速吸收，可满足猪维持能量需要的5%~28%，这部分能量对胃肠道维持正常消化机能有重要的作用，并可促进胃肠道的发育[5，6]，改善营养物质的吸收。因此，适宜的纤维水平饲粮可提高猪的生产性能。

    本试验结果表明，杂交狼尾草替代部分全价料并没有影响肥育猪的生长性能，试验组的饲料转化率提高。与以往添加黑麦草养猪的研究报道[2，7~10]有相似之处，随着杂交狼尾草的替代量增加，Ⅱ组的日增重有下降的趋势，Ⅲ组的日增重有增高的趋势，Ⅳ组又有下降趋势。从杂交狼尾草的营养成分也可以看出，杂交狼尾草的粗蛋白、粗脂肪等营养成分较高，粗纤维的含量较低，比较适合猪的营养需要。

 

    大肠菌群的生长与数量主要与大肠中的营养源(氮源和能量)和肠道食糜的滞留时间有关。当营养源充分，食糜滞留时间较长的时候，微生物才有足够的时间去利用营养物质促进自身的生长;当营养源充分，但是食糜滞留时间较短的时候，微生物来不及利用营养源就随未消化的物质(纤维)排出体外，导致粪便中微生物的种类数量变小，降低多样性参数。大肠中的营养源主要来源于小肠中没有被利用的氮和大肠中纤维发酵产生的能量。在第14天时处理组的条带数显著高于对照组，处理组之间没有显著差异;而在第28天时处理组的条带数也显著高于对照组，Ⅱ、Ⅲ组的条带数显著高于Ⅳ组。这说明在第14天处理组大肠的营养源和食糜的滞留时间有利于大肠中菌群种类数量的增加，而到第28天由于Ⅳ组大肠中菌群种类数量的增加(相对于第14天)，加大对营养物质需求量，并且相对于Ⅱ组和Ⅲ组，有较快的食糜流通速度，导致大肠中菌群种类数量的降低(相对于Ⅱ组和Ⅲ组)。因此添加狼尾草对大肠微生物存在‘量-效’和‘时-效’的关系。

    大肠菌群多态性增加说明大肠中的纤维性物质利于大肠菌群的生长发育，从而也反映适量的纤维性物质刺激大肠菌群利用纤维的能力，也促进猪的生长发育。因此，从纤维对大肠菌群多态性影响的角度可以看出，当全价料与杂交狼尾草的比例为1∶1时，第28天菌群的多样性参数最高，说明这个替代比例比较合适。

参考文献:

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[2]王进波.青绿饲料替代部分精料对生长肥育猪生长性能、胴体特性及消化机能的影响[D].杭州:浙江大学,2001.

[3]Simpson J M,McCracken V J,White B A.Application of denaturantgradient gel electrophoresis for the analysis of the porcine gastroin-testinal microbiota[J].J Microbiol Meth,1999,36:167-179.

[4]刘健华,陈杖榴,李云,等.肠道菌群多样性变性梯度凝胶电泳分析法的建立[J].中国兽医科技,2005,35(6):445-449.

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[6]何海健,马美蓉.全株水稻粉对生长猪生长性能和血清生化指标的影响[J].中国畜牧杂志,2006,42(13):27-28.

[7]Bellof G,Claudia G,Fisher K,et al.The use of wilted grass silage inpigfattening[J].Zuchtungskunde,1998,70(5):372-388.

[8]潘云河,厉化.黑麦草喂猪试验[J].养猪,1996,(1):19-20.

[9]潘永年.饲喂黑麦草对肉猪生长及效益的影响[J].草与畜杂志,1990,(1):17-18.

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